做完了m6A测序后期有哪些高频验证？（带视频教程）| m6A专题

1、整体m6A水平检测（可选，不是必须做的）

目前很多老师还在问，做m6A测序前是否要做一个预实验来验证2组实验组或多组实验组的样本之间整体m6A水平是否有差异？实际上大可不必，具体原因请点击。当然如果真要开展整体m6A水平检测实验，这边推荐质谱法和Dot Blot，不太推荐酶标仪法。

质谱法过程及案例

Dot Blot过程及案例

Dot Blot目前文章用的比较多，折中但是方法比较复杂，条件摸熟练后做出来结果会非常漂亮。参考文献为Nagarajan et al. (2019). Dot Blot Analysis for Measuring Global N6-Methyladenosine Modification of RNA: Methods and Protocols.

酶标仪的最大优势是成本低速度快，3-4小时就能出来结果，但是偏定性，看下趋势就行了，三种方法里最不靠谱但也是最便宜最快的。参考资料为EpiQuik m6A RNA Methylation Quantification Kit P-9005

质谱法LC-MS/MS是目前最靠谱的金标准，但是要找分析化学的人来帮忙，比如食品科学分析化学农药残留等，目前中科院以及一些高校院所有公共平台都有开放。参考文献为：

Kathrin Thüring et al. (2017) LC-MS Analysis of Methylated RNA. Methods in Molecular Biology, 1562, 3

Bifeng Yuan (袁必锋)  (2017) Liquid Chromatography-Mass Spectrometry for Analysis of RNA Adenosine Methylation. Methods in Molecular Biology, 1562, 33.

2. Biotin RNA pulldown挖掘目标结合蛋白

美国希望之城医疗中心的陈建军教授课题组（一作黄慧琳已入职中山大学肿瘤防治中心）使用两种biotin-oligo(带m6A修饰和不带m6A修饰)进行RNA pulldown质谱分析，发现IGF2BP蛋白（IGF2BP1/2/3）显著结合在了带有m6A修饰的oligo上，表明它是m6A结合蛋白。生信分析也证明了IGF2BP蛋白具有较强的m6A结合能力。IGF2BP家族的RIP实验也证实，IP下来的RNA带有很高的m6A修饰水平。

3. mRNA Stability半衰期检测

使用放线菌素D处理mRNA后，用RT-qPCR检测mRNA降解速率。通常这种方法用于验证YTHDF2等reader对靶mRNA降解的影响。同时针对YTHDF1促进翻译，IGF2BP家族维持mRNA稳定性等验证也需要用到该方法。该实验核心处理是放线菌素D。上图为我们推荐的已被引用次数超过1500次的protocol，pubmed ID为19111184。

在上图的案例中，作者在加入放线菌素D后，针对子宫内膜癌中三个被YTHDF2靶向的mRNA，PRR5、PRR5L和mTOR的降解速率进行检测。结果表明，YTHDF2干扰后，这三个mRNA保留事件显著增加。

在下图的案例中，作者使用放线菌素D处理后，番茄SlDML2 mRNA迅速降解。但是当S1ALKBH2与SnDML2在本氏烟草中共表达时，SlDML2的m6A修饰水平显著下降，半衰期有所增加。

4. 荧光素酶报告基因案例之突变甲基化酶

左图中，作者在METTL3敲除的细胞系中转入带有双报告基因的质粒载体，检测Snail基因的翻译水平。右图中，作者则使用瞬时表达系统在本氏烟草中将S1ALKBH2启动子克隆到双萤光素酶报道质粒，该质粒含有萤火虫萤光素酶（Fluc）报告基因和海肾萤光素酶（Rluc）报告基因。当SlDML2与携带有双荧光素酶报告基因的质粒共表达时，相对Fluc活性和Fluc转录水平出现显著上升。

如左上图中，作者对SOCS2的序列中RRACH motif内A碱基替换成C，采用荧光素酶报告基因系统验证m6A修饰对SOCS2基因表达量影响。结果表明WT中荧光素酶报告强度显著降低，而mut中差别不大。

左下图中，作者分别将ASB2和RARA的UTR载体和发生m6A motif突变的载体转染进293细胞，这些载体上带有荧光素酶报告基因，接着使用m6A qPCR来进行验证。结果表明，FTO作用下未发生突变的UTR其m6A水平显著降低，而无论是发生突变的FTO还是UTR都不能显著降低m6A水平。

右图中，作者在前期通过Pulldown以及测序等一系列方法后，通过生信手段确定了MYC转录本的m6A修饰位点后，作者构建了该位点的m6A突变质粒，插入双荧光素酶基因，进行双荧光素酶报告基因检测。从结果可以看到，IGF2BP1-3可与CRD区域结合，但当CRD的m6A区域突变后，IGF2BP1-3不能与CRD结合。

5. 体外(in vitro)Oligo验证实验

该实验顾名思义，就是在非生物体中验证。目前包括Takara等在内的公司可以帮助合成客户需要验证的某段序列，也叫oligo（全称是oligonucleotide）。通常长度不建议超过30nt，上面的腺嘌呤A碱基可以自行决定是否带有m6A修饰。而要与之互作的蛋白建议使用酵母体系进行过表达和纯化，不推荐使用原核细菌如大肠杆菌的表达体系。

当然，也可以直接提取细胞或组织中的蛋白与合成的寡核苷酸oligo进行反应。或者可以使用293等工具细胞过表达某目标蛋白且携带FLAG、GST等外源性标签蛋白方便后期富集。

左图中作者将GFP荧光蛋白mRNA（分别带有和不带有m⁶A修饰）注射进入胚胎细胞中并用qPCR验证。结果表明，在野生型胚胎中带有m⁶A修饰的mRNA被降解的速度更快，在YTHDF2突变型胚胎中，发生m⁶A修饰的mRNA降解受到影响。

右图中，作者含DGCR8和DROSHA等微处理蛋白的HEK293细胞提取物后，通过Northern blot发现，发生m⁶A修饰的pri-let-7（人工合成）比未发生m⁶A修饰的pri-let-7通过微处理蛋白复合物作用后产生pre-let-7的效率会更高。接下来，作者对pri-let-7e上的五个A全部进行点突变，结果miRNA成熟体生成效率降低。

左图中，作者在体外（in vitro）验证实验中，将纯化的HNRNPA2B1蛋白与带m⁶A修饰的RNA探针进行结合实验，并用非甲基化的RNA探针以及其他类型的hnRNPC作为对照。

右图中，作者对番茄SlALKBH2蛋白进行纯化后，一带有m⁶A修饰的ssRNA/oligo（14nt）作为底物进行去甲基化反应。高效液相色谱对ssRNA/oligo进行分析后发现，体外重组蛋白SALKBH2能够有效去除ssRNA/oligo上的m⁶A修饰

6. RIP-seq+翻译组等多组学是m6A高分文章利器

翻译组测序能够解释mRNA→蛋白这一步骤具体实现的效率，而RIP-seq则可以进一步验证发生m6A修饰的mRNA在后期发挥哪些生物学功能。只有m6A-seq的单薄之处在于挖掘到带有m6A修饰的基因数量偏多，下游生物学故事仍然是一片空白.

左图中，作者组利用m⁶A测序、翻译组测序和RIP-seq发现CDK2、CDK4等关键基因的翻译机制。其中CDK2等mRNA上携带有m6A修饰继而被YTHDF1识别，从而促进蛋白翻译。

右图中，作者利用IGF2BP家族的RIP-seq以及翻译组测序后掘到了一系列下游重要靶基因如MYC等。其中无论是m6A测序还是三个蛋白的RIP-seq数据，都明显靶向了MYC的CRD区域，五个测序结果都在此出现了显著的信号峰。

7. 植物专属后期验证7.1
qPCR/GUS染色/亚定位检测甲基化酶差异

使用GUS染色以及亚定位的方式去检测m6A甲基化酶在植物体内的各个部门的时空表达，是植物学研究中尤其是模式植物必备的方法。目前已被诸多高分文章采用。

7.2
 共聚焦与荧光成像（互作与定位）

步骤①：获得转基因植株。所述转基因植物（原生质体制备）的细胞核中可以表达绿色荧光蛋白或其他标签蛋白；步骤②：共聚焦成像。用快速高分辨激光共聚焦显微镜对所述转基因植物进行观察，并对观察成像结果拍照记录和备份。

7.3
酵母双杂（研究m6A蛋白互作蛋白）

通过酵母双杂实验，可以锁定植物一些常规的m6A酶如MTA、MTB、FIP37、ALKBH9、ECT2等蛋白互作的一些其他蛋白，为后期植物体内探索深层次的分子机制打下基础。

7.4
 烟草瞬转实验

理论上烟草瞬转是一个大方向。因为基于农杆菌侵染的烟草叶片瞬时表达系统是当下最实用、简便且强大的植物在体基因功能验证体系，几乎每一篇涉及植物基因功能验证的实验性论文都会用到这项技术。具体应用包括：蛋白亚细胞定位（荧光蛋白融合表达）、蛋白互作（BiFC、FRET、pulldown、Co-IP等）、蛋白-核酸互作（ChIP、RIP等）、酶活验证或候选酶筛选、代谢工程、基因功能验证（VIGS、RNAi）等等。

尤其是一些非模式植物，无法构建突变体的重要研究性状，都可以在烟草上表达对应的基因进行后续的实验验证。

8. 体外验证：蛋白突变及探针阴阳性对照

植物通常很多为非模式生物，需要鉴定m6A甲基化酶的功能。Blast之后需要对保守功能结构域进行特定突变失能，然后与携带有m6A修饰的oligo探针（30nt）进行体外结合实验，证明功能。

最后，这边附上本期内容的视频号内容回放

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